Etablierung eines Nachweissystems zur Quantifizierung von Cytochrom P450 Enzymen in der menschlichen Leber

Abstract

Den Abbauprozessen von Fremdstoffen kommt vor allem in der pharmazeutischen Industrie großes Interesse zu. Die größtenteils auf mRNA-Expressionsstudien und Enzymaktivitätstest beruhende Erforschung des Fremdstoffmetabolismus kann durch die in dieser Arbeit entwickelte Quantifizierungsstrategie um die Information des Proteingehalts ergänzt werden. Der Konzentrationen der Cytochrom P450 Enzyme stellen einen wichtigen Baustein für die Untersuchung pharmakokinetischer Prozesse dar.

Die entwickelten CYP-TXP-Tests quantifizieren die im menschlichen Fremdstoffmetabolismus beteiligten Cytochrom P450 Enzyme spezifisch und sensitiv. Die Tests erlauben es, simultan in einem einzelnen LC-MS-Lauf mehrere Analyte zu vermessen. Die zwei entwickelten multiplexen Quantifizierungsaufbauten sind in der Lage, nach Immunopräzipitation die Quantifizierung aller 15 im Fremdstoffmetabolismus relevanten Cytochrom P450 Enzyme, sowie des ABC-Transporters MDR1 und der NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase zu ermöglichen. Die verwendeten TXP-Antikörper wurden eingehend charakterisiert und validiert. Neben der Bestimmung der Dissoziationskonstanten und Bindekapazitäten wurde der lineare Messbereich der TXP-Tests bestimmt. Ein breiter linearer Messbereich ermöglicht es, stark variierende Konzentrationsspiegel ohne Anpassung des Probevolumens zu vermessen. Somit sind die TXP-Tests besonders für Induktionsstudien geeignet und werden gleichzeitig den in der Bevölkerung stark schwankenden Expressionsspiegeln der Cytochrom P450 Enzyme gerecht. In Induktionsexperimenten konnten hierbei in der Literatur beschriebene Induktionsprozesse bestätigt werden. In Adriamycin-resistenten Zellen wurde zudem eine gesteigerte Expression des MDR1-Transporters nachgewiesen.

Die hohen Sensitivitäten der TXP-Tests erlauben es, Cytochrom P450 Enzyme aus Lebergewebe ohne vorhergehende Mikrosomenpräparation zu quantifizieren. Die Quantifizierung der Cytochrom P450-Enzyme kann hierbei sowohl aus mikrosomalen Präparationen, als auch aus Gewebe erfolgen. Kleinste Gewebe- oder Zelllysatmengen von weniger als 10 μg Gewebe reichen für eine robuste Quantifizierung aus. Die entwickelten CYP-TXP-Tests eignen sich somit für die Quantifizierung in miniaturisierten Zellkulturexperimenten im 96-Well-Format.

The degradation processes of xenobiotics are primarily of interest to the pharmaceutical industry. The quantification strategy developed in this thesis completes the research of drug metabolism mostly based on mRNA expression studies and enzyme activity tests with the knowledge of the protein amount. The concentration levels of cytochrome P450 enzymes build an important component for the investigation of pharmacokinetic processes.

The developed CYP-TXP-tests are able to quantify the cytochrome P450 enzymes in a specific and sensitive way. The tests permit the simultaneous quantification of several analytes in only one LC-MS run. Two quantification setups were developed which have the ability to quantify 15 cytochrome P450 enzymes as well as the abc-tansporter MDR1 and the NADPH-cytochrome-p450-oxidoreductase after immunoprecipitation. Employed TXP-antibodies were characterized and validated in-depth. In addition to dissociation constants and binding capacities the linear ranges of the TXP-tests were determined. A broad linear range affords to measure highly varying concentration levels without adapting sample volumes. Thus the TXP tests are particularly suitable to conduct induction studies and meet very fluctuating expression levels of cytochrome P450 enzymes in population. Induction experiments confirmed induction processes described in literature. Furthermore an increased expression of the transporter protein MDR1 was demonstrated in Adriamycin-resistant cells.

The high sensitivities of the TXP-tests enable the quantification of cytochrome P450 enzymes in liver tissue without preparing microsomes. It is possible to quantify cytochrome P450 enzymes out of both microsomal preparation and tissue. Very small amounts of tissue or cell lysate are sufficient to quantify out of 10 µg tissue in a robust way. Therefore the developed CYP-TXP-tests are suited for the quantification in miniaturised cell culture experiments using the 96-well-format.