Miniaturisierte Affinitätsanalytik - Ortsaufgelöste Oberflächenmodifikation, Assays und Detektion

Abstract

Zielsetzung der Arbeit war die Untersuchung miniaturisierbarer und parallelisierbarer Verfahren für die heterogene Affinitätsanalytik und die Optimierung dafür notwendiger spezifischer Oberflächen. Dabei wurden drei Schwerpunkte gesetzt: 1. Die parallelisierbare spektrale SPR wurde hinsichtlich ihres Potentials für die Affinitätsanalytik bzw. ihrer Miniaturisierbarkeit und ihrem Einsatz als per Lichtleiter fernabfragbares Detektionssystem untersucht. 2. Neue Protokolle zur Oberflächenmodifikation für die Affinitätsanalytik wurden am Beispiel der Immunanalytik und der DNA-Analytik etabliert. Die vorgestellten Modifikationen sind gekennzeichnet durch einfache und flexible Schritte. Eine in diesem Feld noch ziemlich neue Technik - die Tintenstrahltechnologie - wurde zu diesem Zweck zu einer reagenziensparenden Methode für die ortsaufgelöste Oberflächenchemie entwickelt. Kovalente Bindungsstrategien erwiesen sich als bester Modifikationstyp bezüglich regenerierbarer Transduceroberflächen. Die Ortsauflösung der homogenen Spot-Flächen war variabel in einem Bereich von 0.01 bis mehrere mm². Die Reaktionszeit der Kupplungschemie betrug hierbei nur den Bruchteil einer Sekunde. Derart hergestellte DNA-chips wiesen Hybridisierungskapazitäten von weit mehr als 200 fmol/mm² auf, bei keiner beobachteten unspezifischen Wechselwirkung. Neben der Ortsauflösung bietet diese Methode einen um 1E-4 kleineren Reagenzienverbrauch gegenüber konventioneller Technik von Hand - bei vergleichbaren affinen Bindungsergebnissen. 3. Ein neuartiger, waschfreier, heterogener und inzwischen auch patentierter Immunoassay wurde entwickelt. Dieser sogenannte Phasenseparations-Fluoreszenzimmunoassay (PSFIA) wurde zunächst in der Mikrotiterplatte erprobt und anschließend erfolgreich in den Nanolitermaßstab (Nanotiterplatte) übertragen.

Aim of this work was the investigation of affinity sensing techniques with a potential for parallel and miniaturised set-ups. Therefore also new ways to obtain patterned surfaces with specific binding properties should be developed. So this work can be divided in three main parts: 1. Spectral surface plasmon resonance (SPR) was investigated regarding to its potential as a miniaturised remote sensing tool for affinity analytics. 2. New protocols in surface modification chemistry for the use in affinity analytics were established, and tested especially for immuno- or DNA-analytics. Simple and flexible steps with minimised sample consumption lead to a spatially resolved surface modification. For this reason ink-jet technology - a rather new technique in this field - was employed. Best results were achieved with covalent binding strategies regarding to regenerateable surfaces. The coupling chemistry was finished in a split second and the covered area was homogeneous in single and multiple spot areas of 0.01 to several mm². DNA-chips with high hybridisation capacities of more than 200 fmol/mm² were no problem at all, whereas non-specific binding was not observed. Compared to usual protocols by hand ink-jet technology offers beside spatially resolved chemistry also a reduced sample consumption of 1E-4 and similar affinity binding results. 3. A new type of heterogeneous immuno assay in nanoliter format was developed. This fluorescence based and wash free approach was successfully developed in microtiter plate format and transfered in self-designed nanotiterplates. It lead to a patent and was called phase separated fluorescent immuno assay (PSFIA).